1：雙熒光素酶報告基因適反應(yīng)溫度？

　　A：室溫（20-22℃）。反應(yīng)時各個組分（細(xì)胞裂解產(chǎn)物，底物工作液等）都需要調(diào)整到室溫。此兩種熒光素酶的反應(yīng)速率是受溫度影響的，為了保證實驗的一致性，我們推薦此兩種工作液在檢測時都孵育至室溫。

　　2：雙熒光素酶報告基因載體該如何選擇？

　　A：1）螢火蟲熒光素酶建議選取pGL-3或pGL-4或者自己構(gòu)建的載體

　　2）海腎熒光素酶建議選取phRL-TK或pGL-4載體或者自己構(gòu)建相應(yīng)的載體。建議海腎載體不使用強啟動子（如SV40、CMV），而選用中等強度的啟動子（如TK）。

　　3：檢測的熒光數(shù)值很低怎么辦？

　　A：檢測的熒光數(shù)值很低說明細(xì)胞裂解液中的熒光素酶含量很低。通常解決辦法為

　　1）轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒采用細(xì)胞轉(zhuǎn)染級別的質(zhì)粒抽提試劑盒抽提。

　　2）優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，盡可能的提高轉(zhuǎn)染效率。

　　3）增加實驗的細(xì)胞量，并且裂解細(xì)胞時，適當(dāng)減少細(xì)胞裂解液的量。

　　4：進(jìn)行檢測的過程中，熒光信號值太高該如何進(jìn)行調(diào)整？

　　A：1）在轉(zhuǎn)染實驗后，減少細(xì)胞的孵育時間。

　　2）降低熒光信號采集時間。

　　3）進(jìn)行樣品的稀釋。

　　5：螢火蟲熒光素酶讀值和海腎熒光素酶讀值的比例多少時比較合適？

　　A：盡量保證對照組的螢火蟲熒光素酶的讀值和海腎熒光素酶的讀值接近，或者海腎熒光素酶的讀值比螢火蟲熒光素酶的讀值稍高。對于具體的實驗過程中，由于螢火蟲熒光素酶質(zhì)粒和海腎熒光素酶的質(zhì)粒抽提的質(zhì)量不一致，待檢測目的調(diào)控元件的調(diào)控能力的不同等原因，一次實驗很難達(dá)到一個比較好的實驗結(jié)果，因此對于此實驗，我們推薦預(yù)實驗優(yōu)化螢火蟲熒光素酶質(zhì)粒和海腎熒光素酶質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染量。